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干货丨RAW 264.7养不好，分化了怎么办？
RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）来源于雄性小鼠中由Abelson小鼠白血病病毒诱导的肿瘤。由于它具有吞噬作用和胞饮作用，这种贴壁细胞被认为是巨噬细胞的体外理想模型。RAW264.7细胞还应用于天然产物筛选、破骨细胞研究、微生物免疫调节等领域。此外，还可利用基因编辑RAW264.7细胞验证炎症靶点、巨噬细胞基因功能研究等。
养好细胞是开展细胞实验的前提，养过RAW 264.7细胞的同学应该都知道这种细胞十分娇气，在培养过程中容易分化（会长出小触角），分化后不及时处理可能会耽误实验进程。想要养好RAW264.7细胞，培养中的每个步骤都很关键，拥有多年细胞培养经验的小源拿出源井专属的“葵花宝典”，一步一步来教你如何减少细胞分化情况。
在干货分享前，我们先梳理一下RAW 264.7细胞的基础信息。
细胞名称 | RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞） |
生长特性 | 贴壁生长 |
细胞形态 | 圆形，培养时会出现少量（10%）梭形、多角形的分化细胞属于正常现象。 |
细胞培养基 | DMEM＋10%FBS＋1%P/S； |
培养环境 | CO2，5%；温度：37℃ |
换液频次 | 每天换液 |
传代比例 | 1：3-1：6 |
RAW 264.7细胞生长正常图片
细胞复苏操作流程：
1)
准备工作：：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟。
2)在超净台内吸取7 mL完全培养液至15 mL离心管中
3)将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在 1 分钟左右完全融化；
4)将细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，离心1100 rpm 室温 4 分钟；
5) 超净台内吸弃上清，吸取1 mL完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，转移至装有4 mL完全培养液的T25 cm2培养瓶 (或者6 cm的皿) 中，写上细胞名称、复苏日期、 代次，放置 37℃、5% CO2培养箱中培养；
6)第二天观察细胞状态及贴壁情况。
复苏关键要点：
1.复苏操作时间不可太长，尽量在15min内完成。
2.若复苏后24h细胞状态不好或分化较多，建议再次复苏时根据细胞量复苏到六孔板里。
3.请勿直接复苏到T75cm2瓶或10cm的皿。
细胞传代操作流程：
1）汇合度达到70-80%时可进行传代，传代比例1:3-1:6
2）吸出原培养液，直接吸取新鲜的完全培养液轻柔吹打成单个细胞，在显微镜下观察细胞是否为单个细胞。
3）按一定比例接种传代，第二天观察细胞状态。
传代关键要点：
1.该细胞不可用胰酶消化。
2.血清质量差异可能会对细胞生长有影响，建议使用高级血清进行培养，如果没有高级血清，可提高血清浓度进行培养。
3.通过传代可以改善细胞分化的比例，由于Raw264.7细胞生长速度很快，一般2-3天即可传代，因此传代间隔不能超过三天，若超过会使细胞更容易分化，分化的细胞贴壁牢固，难于吹下，所以需要控制好每次的接种密度。
4.若分化细胞占比很大，待细胞长至70-80%汇合度后用单道移液器将表面未分化的圆形细胞轻柔吹下转移至新的培养板里并吹成单细胞（注意接种密度，不可过稀），只吹一下即可，避免把分化的细胞也一并吹下培养，之后2-3次传代如上述操作可得到正常的细胞。
敲重点，小源来举个例子：
如果RAW 264.7细胞在T25瓶里分化细胞占比大，可以用2-3ml培养基轻柔吹打细胞表面，注意不要产生气泡。把表面未分化的细胞收集下来养到合适孔板。在显微镜下观察是否成单细胞，若是单细胞则放到培养箱培养。约3-4h细胞就会贴壁80-90%，再次观察细胞状态，若此时大部分细胞是独立成个且圆形的，那么第二天细胞就不会出现聚团现象且分化细胞有减少。
RAW 264.7细胞生长分化图片
细胞冻存操作流程：
1）按细胞传代的方法，把细胞吹打成单细胞悬液，转移至离心管中。
2）吹打混匀，计数；
3）1100 rpm室温离心4 分钟，离心完弃上清，加入4℃预冷的冻存液重悬细胞，并调整密度为1x106-1x107 个细胞/mL。
4）按1 mL/管分装至冻存管中，将冻存管放置于4℃预冷的程序降温盒中，并将程序降温盒放置超低温冰箱。
5）过夜后，将冻存细胞转移至液氮罐内保存。
看完分享的干货，是不是对RAW 264.7细胞分化问题不再束手无策。如果你觉得有用，可以分享给身边养RAW 264.7细胞的小伙伴一起来学习！
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